脂质体2000转染DNA的操作过程

 　　脂质体2000适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下zui方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

　　用脂质体2000进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者*的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

　　细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

　　快速脂质体转染法操作步骤如下：

　　(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。

　　(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

　　①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

　　②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

　　③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。

　　(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。

　　(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，

　　(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。

　　(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

　　稳定的脂质体转染方法如下：

　　(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

　　(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

　　(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。

　　(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。

　　注：脂质体，即lipofectin regeant，LR