CCK8试剂盒日本同仁常见问题解答(一)

 　　CCK8试剂盒日本同仁是常用的试剂盒之一，很多客户在使用时都会有一些疑问，北京沃比森整理总结一些常见的问题，希望给大家一些参考和借鉴。

　　1、一个孔中应接种多少个细胞?当使用标准96孔板时，贴壁细胞的zui小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

　　2、CCK8试剂盒日本同仁能否对活细胞进行染色?不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8)，并通过电子载体1Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染色。

　　3、CCK8检测溶液对细胞是否有毒?CCK8溶液自身因为高浓度的1Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。

　　4、在做加药实验时，药物对测定是否有影响?如何解决?有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8之前更换培养基，去掉药物的影响。

　　5、每次测定的数值不一样，是什么原因?如何解决?可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板zui外一圈的孔zui容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。 一般情况下，zui外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000个/孔范围内摸索条件。

　　6、如何设定空白对照?在不含细胞的培养基中加入CCK8试剂盒日本同仁，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

　　7、能否用384孔板进行试验?可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。

　　8、能否用24孔板进行试验?可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。

　　9、哪些物质会影响CCK8的测定?当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

　　10、在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决?可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如：可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

　　11、酚红会影响检测吗?不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

　　12、CCK8试剂盒日本同仁与胸苷结合检测之间是否有相关性?有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。

　　13、CCK-8能否检测细菌细胞?可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。

　　14、CCK8试剂盒日本同仁稳定吗?CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。

　　15、如果没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片?还可使用450 nm到490 nm之间的滤光片。