脂质体2000转染法的详细操作步骤分享

　　1、操作步骤[方法一]：

　　(1)脂质体2000的转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

　　(2)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

　　(3) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

　　(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

　　(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

　　注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

　　2、快速脂质体2000转染法操作步骤如下[方法二]：

　　(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。

　　(2)在试管中配制DNA/脂质体2000复合物方法如下：

　　①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

　　②旋转1秒钟，再加入脂质体2000悬液，旋转。

　　③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体2000上。

　　(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。

　　(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，

　　(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。

　　(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

　　3、稳定的脂质体转染方法如下：

　　(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

　　(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

　　(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。

　　(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。