了解一下活性氧检测试剂盒的操作过程吧

　　活性氧检测试剂盒是一种基于荧光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的常用方法。
 

　　下面让我们来了解一下活性氧检测试剂盒的操作过程吧
 

　　一、装载探针
 

　　1、原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
 

　　1)细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
 

　　注：必须保证细胞状态健康，且检测时不会过度生长。
 

　　2) 药物诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。
 

　　阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。(如，HeLa细胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h;)
 

　　3)探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
 

　　4) 探针装载：吸除诱导用药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。例如;对于6孔板通常不少于1000 μL，对于96孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。
 

　　5) 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
 

　　2、收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。
 

　　1) 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
 

　　2)药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。(可选)阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。【如，HeLa细胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h;】
 

　　3) 探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
 

　　4) 探针装载：去除细胞内药物，离心收集细胞，加入适当稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。
 

　　注：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。如，对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。每隔3-5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
 

　　5)细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
 

　　二、检测
 

　　原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
 

　　收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。